Per disegnare dei primers non c'è una scienza empirica..diciamo, non esiste una legge infallibile.
Dipende dalla strategia adottata dal ricercatore.
I passaggi da conoscer in ogni caso sono:
La prima cosa è conoscer la regione che si intende amplificare; poi dovresti disegnare 2 primers che amplifichino solo la regione di interesse...Quindi:
Entrambi i primer devono essere complementari alle estremità della sequenza di interesse: in modo da non amplificare sequenze aspecifiche adiacenti e per non perdere materiale nel prodotto.
Il DNA è a doppio filamento e la polimerasi amplifica in direzione 5'->3' e tu dovrai far in modo che quest'ultima sintetizzi i filamenti nel verso giusto!
Quindi dovrai fare un primer che ibridi in un filamento e uno che ibrida sull'altro...però c'è un problema..di solito durante gli esercizi si ha a disposizione la sequenza di un filamento!
quello che dovrai fare è scrivere un primer UGUALE all'estremità 5' del filamento e un altro COMPLEMENTARE all'estremità 3'!
il primo primer sarà poi complementare all'estremità 3' dell'altro filamento e in questo modo le estremità 3' dei primers sono orientate nel verso giusto e sei sicuro che la polimerasi sintetizzerà nel verso giusto.
La lunghezza dei primers è variabile...non devon esser troppo piccoli ne eccessivamente lunghi. Ma fondamentalmente ricordati che i primers non devono avere per forza la stessa lunghezza, ma dovranno avere Temperature di melting più simili possibili!!
Empiricamente essa si misura T°=(G+C)*4 + (A+T)*2
Quello che ti consiglio di far son primers più lunghi di 15 basi e che abbiano T di melting simili.
dopo di che tutto va bene ^^