Sequenziamento del DNA reagenti, kit e strumenti
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L'analisi di sequenza degli acidi nucleici rimane sempre il modo migliore per ottenere informazioni precise e definitive su un gene o una sua parte. Ad esempio, è il metodo ideale per la rilevazione di mutazioni altrimenti difficilmente evidenziabili e di mutazioni puntiformi eterozigoti.
I laboratori impegnati nella ricerca sul genoma, nei test genetici e nel drug discovery eseguono tutti i giorni procedure di sequenziamento ex novo, sequenziamento comparativo, mapping e rilevazione di mutazioni, spesso su larga scala. Nei laboratori dove il carico di lavoro di sequenza è elevato, si usano sequenziatori automatici basati su slab gel o sull'elettroforesi capillare in cui la corsa dei frammenti, la rilevazione delle bande e l'identificazione delle basi avvengono in modo completamente automatico.
L'obiettivo è quello di ridurre al massimo le operazioni manuali - per una maggiore riproducibilità ed accuratezza- e, se possibile, anche i costi dei consumabili. Per ridurre i tempi delle procedure di sequenziamento sia automatico sia manuale, il mercato offre ad esempio soluzioni di gel già pronte, tamponi di corsa premiscelati e addirittura gel preformati. Per non parlare di kit e reagenti per il sequenziamento per applicazioni standard, oppure ottimizzati per specifiche applicazioni.
Le tecniche di sequenziamento
Le prime tecniche di sequenziamento del DNA sviluppate sono state il metodo chimico di Maxam e Gilbert e quello enzimatico di Sanger.
Il sequenziamento di Maxam e Gilbere, basato sull'impiego di un procedimento chimico per il taglio parziale del DNA, è laborioso, necessita di radioattività e di reagenti altamente tossici. Per questi motivi questo metodo è stato rapidamente soppiantato dalla tecnica di sequenziamento enzimatico, sviluppata non molto tempo dopo da Sanger. La tecnica si basa sul principio della terminazione della catena di DNA di neosintesi - complementare a quella stampo - grazie all'inserimento di dideossinucleotidi a livello di basi specifiche.
La DNA polimerasi attualmente più usata con questa tecnica è la T7 DNA polimerasi (fig. 1). Per ridurre la compressione delle bande durante l'elettroforesi, dovuta alla formazione di strutture secondarie del DNA, frequente soprattutto per sequenze ricche di G e C, si possono usare miscele di 7-deaza-dGTP o di dITP, invece che dGTP.
I protocolli di sequenziamento tradizionali secondo Sanger sono adatti per frammenti di DNA clonato come templati - perché da essi si può preparare DNA a singolo filamento (single strand, ssDNA) - mentre non producono risultati totalmente riproducibili a partire da templati a doppio strand (dsDNA)come i prodotti PCR.
Il cycle sequencing
Il sequenziamento affidabile dei prodotti PCR si ottiene con cycle sequencing - caratterizzato da alta temperatura e molteplici passaggi di denaturazione - oppure con il sequenziamento isotermico ad alta temperatura che, diversamente dal cycle sequencing, consiste in un'unico round di sintesi di DNA a temperature di 65-70°C o più.
Una delle prime modificazioni della tecnica di amplificazione del DNA Polymerase Chain Reaction (PCR) per applicazioni specifiche è stata proprio quella che ha portato alla messa a punto del cosiddetto "cycle sequencing". In questa variante della PCR, il DNA viene amplificato con una DNA polimerasi termostabile a partire da un unico primer di sequenza in presenza di ddNTPs che bloccano la polimerizzazione a livello di basi specifiche.
Essendo a tutti gli effetti ancora un'amplificazione termica, il cycle sequencing è in grado di produrre ottimi risultati anche a partire da basse quantità di DNA, nell'ordine di femto/picomoli (singole colonie o placche possono fornire una quantità di templato sufficiente per il cycle sequencing). Oltre ad avere una sensibilità molto maggiore di quella del sequenziamento tradizionale, l'elevata temperatura propria del cycle sequencing riduce o elimina le strutture secondarie del DNA e riduce anche il priming interno aspecifico che può generare artefatti di sequenza.
Esistono in commercio anche dei kit di cycle sequencing che permettono di fare letture lunghe. Di solito questi kit sono studiati per il sequenziamento automatico ed usano un metodo di marcatura non radioattivo: si riescono a leggere più di 1000 basi a partire dal primer con una minima percentuale di errore.
Enzimi termostabili per
cycle sequencing
Il cycle sequencing utilizza come DNA polimerasi termostabile un derivato della Thermus acquaticus polimerase (Taq) specifico per sequenza. Tali enzimi hanno in genere una stabilità termica migliore di quella dell'enzima nativo (emivita di 2.5 ore a 96-98°C) e, soprattutto, sono privi dell'attività 5'-3' esonucleasica normalmente associata alla Taq. Questo tipo di derivato della Taq è consigliato per reazioni di estensione dal primer di addirittura 4000 bp.
In alternativa alla Taq, i kit per cycle sequencing possono includere l'enzima Tth o un derivato della DNA polimerasi Pfu (un exo- Pfu, cioè un enzima senza l'attività esonucleasica 3'-5' della Pfu nativa).
Apparati elettroforetici per sequenza di DNA
I gel di sequenza, di poliacrilammide, sono corsi in condizioni denaturanti (in presenza di urea) su apparati verticali lunghi o molto lunghi a seconda del numero di basi che si vuole leggere e della separazione voluta.
Il tampone di corsa (in genere una soluzione di Tris Borato EDTA, TBE) viene versato nella vaschetta inferiore e in quella superiore separate tra loro dalla piastra verticale che sostiene il gel. L'altezza, lo spessore e la composizione del gel possono essere modificati in base ai tempi e alle lunghezze di corsa richieste, mantenendo la stessa risoluzione tra singole basi. Per aumentare la produttività nel sequenziamento di brevi frammenti di DNA, si può usare ad esempio una apparato più corto: la velocità di migrazione può aumentare infatti fino a 500 basi all'ora con queste distanze di separazione minori.
Il gel di sequenza sono in genere "slab" gel molto sottili, che producono una elevata resistenza elettrica e sono sottoposti a voltaggi-amperaggi elevatissimi che producono molto calore.
Per assicurare il trasferimento di calore e garantire l'uniformità della migrazione, evitando il cosiddetto effetto 'smile' in cui i campioni caricati nella parte centrale del gel migrano più velocemente di quelli caricati ai lati, si usano di solito delle piastre di alluminio. L'aggiunta di una ventola (in genere opzionale) consente un ulteriore controllo della temperatura del gel e permette una maggiore velocità di corsa. Un altro optional che si può acquistare è una termosonda per il controllo del calore prodotto.
Sul mercato si trovano anche apparati per sequenza di altezza regolabile che danno la flessibilità di poter correre gel di sequenza con lunghezze comprese tra 22 cm e 1 m. Questi apparati di sequenza regolabili esistono anche in versione doppia, offrendo la possibilità di correre un numero doppio di campioni usando meno volume di tampone e risparmiando spazio prezioso sul bancone.
In commercio esistono poi degli apparati con due porte d'accesso e un coperchio di sicurezza, per un accesso al caricamento dei campioni facile, ma nello stesso tempo privo di rischi. Infatti, tutti i componenti sono protetti e l'apparato non funziona finché le porte non sono chiuse e il coperchio di sicurezza non è in posizione corretta (fig. 2).
In questo, come in altri modelli, il tampone di corsa può essere facilmente svuotato dal contenitore superiore attraverso un foro di scarico e il serbatorio inferiore è spesso removibile per facilitare la pulizia.
Oltre ai classici sistemi di assemblaggio per gel verticali di acrilammide in unità per più gel, in commercio esistono anche alcuni sistemi semplificati per il casting di gel verticali di diverse dimensioni. Esiste ad esempio un sistema di guarnizione a prova di perdita che sigilla il sandwich di lastre di vetro, permettendo un rapido e facile casting. Questa tecnica è particolarmente utile per il casting di slab gel verticali e in particolare gel lunghi e sottili come quelli per sequenziamento.
Tamponi e soluzioni di gel pronte all'uso
Per i gel di sequenza sono disponibili soluzioni già pronte e premiscelate di 10x Tris Borato EDTA (TBE) che evita la pesatura della polvere e in genere la variabilità dovuta alla preparazione del tampone. Sul mercato si può acquistare anche una soluzione 10% di ammonio persolfato (APS) - che serve come catalizzatore della polimerizzazione del gel di acrilammide - che può essere mantenuta a 4°C per diverse settimane.
Vengono vendute soluzioni di acrilammide già pronte (non è quindi necessario pesare l'acrilammide, né dissolvere urea...). Alcune delle soluzioni di acrilammide commerciali sono fornite poi come premix contenenti urea e TBE. Basta aggiungere APS e Temed, e il gel è pronto da versare: non è necessario degasarlo né filtrarlo previamente.
Per ridurre il rischio di rottura del gel in applicazioni di sequenziamento esiste una speciale soluzione di acrilammide con una resistenza tensile doppia rispetto a quella normale, che può essere usata. Si può usare per gel di qualsiasi formato, per basse o alte concentrazioni di acrilammide.
In commercio ci sono poi soluzioni di gel con una formulazione ottimizzata per il sequenziamento sia manuale sia automatico. Con questo tipo di soluzioni al 4%, 5% e 6% è possibile leggere da 400 bp fino a 500 bp con il 98% di accuratezza: il minore rumore di fondo consente una migliore identificazione delle basi.
Per applicazioni di sequenziamento automatico standard e ad alta produttività si possono scegliere soluzioni di gel pensate ad hoc.
Esiste ad esempio una soluzione di gel costituito da una soluzione stock di monomero di acrilammide, polimeri di comonomeri e un nuovo cross linker, per migliorare di molto la risoluzione e la lunghezza di lettura con il sequenziamento sia manuale sia automatico.
La maggiore grandezza e uniformità dei pori permette una più veloce migrazione del DNA rispetto a un gel con pari concentrazione di acrilammide, fornendo fino al 30% di informazioni in più. La soluzione permette di preparare con facilità gel di diversa concentrazione e tampone. Può anche essere usato con i sequenziatori automatici per aumentare la lunghezza di lettura o diminuire il tempo di corsa.
Queste soluzioni di gel sono garantite per i più importanti sequenziatori presenti in commercio per una lunghezza di lettura di 500 oppure oltre 700-800 bp (a seconda della concentrazione di acrilammide, in genere dal 4% al 6%).
Gel di sequenza già polimerizzati
Per versare un gel nel modo convenzionale ci possono volere anche due ore. Infatti è necessario assemblare l'apparato, miscelare i reagenti, degasare la soluzione del gel, versare il gel e far completare la polimerizzazione.
Inoltre, le operazioni manuali costringono alla manipolazione di sostanze tossiche e i gel che si ottengono non sempre sono tra i migliori (ad esempio possono contenere bolle).
Per far risparmiare tempo e garantire risultati più riproducibili si possono acquistare gel di poliacrilammide per acidi nucleici già pronti adatti per molteplici applicazioni. Alcuni gel preformati hanno il vantaggio che, essendo già fissati alla lastra di vetro, non necessitano di essere trasferiti su carta da filtro.
In commercio si trova un sistema di sequenziamento che è stato disegnato in modo da dimezzare i tempi di elettroforesi e di essicazione del gel (permettendo di risparmiare ben quattro ore). Il sistema include un nuovo dispositivo di sequenziamento verticale, un gel dryer ad alta velocità e un grande assortimento di accessori.
Per questo sistema sono disponibili diversi tipi di gel già polimerizzati pronti da caricare in appena 30 minuti con o senza pozzetti preformati. L'assemblaggio dell'apparato e del gel preformato avviene in quattro semplici passaggi (fig. 3).
A seconda dell'applicazione voluta, del numero di basi che si desidera sequenziare si può scegliere un gel precast denaturante al 4,5%, al 5,5 (Long Ranger) e 12%. Il gel preformato 5,5% Long Ranger è il primo tipo di gel precast pensato per il sequenziamento automatico e l'analisi genetica (adatto ai sequenziatori LI-COR).
I pozzetti preformati riducono la contaminazione crociata tra una corsia e l'altra, sono facili da caricare e si possono usare pipette multicanale per il caricamento simultaneo di parecchi campioni.
Una alternativa ai gel già polimerizzata è rappresentata da un gel impaccato in una busta contenente tre comparti: il comparto più grande contiene 70 - 80 ml di una miscela di acrilammide specificamente formulata per il sequenziamento automatico, mentre i due comparti più piccoli contengono APS e TEMED per la polimerizzazione del gel. È sufficiente premere sulla busta per rompere i sigilli che separano gli scomparti e poi agitare dolcemente e si otterrà un gel in grado di polimerizzare in 15 minuti (fig. 4). Queste buste suddivise in comparti sono stabili per circa un anno a 2-8°C.
Accessori per slab gel verticali
Pettini
Per il sequenziamento del DNA mediante elettroforesi su slab gel di usano due tipi di pettini: quelli ad angolo retto e quelli a "dente di squalo". Il numero di campioni che si può caricare con un singolo pettine spazia in genere da 12 fino a 96; tra questi due estremi vi sono pettini con numero di pozzetti molto variabile (i più usati sono però quelli da 24, 36 e 48 pozzetti). Anche lo spessore è estremamente variabile: è generalmente compreso tra 0,25 mm e 2 mm. Ovviamente lo spessore del pettine prescelto dovrà essere identico a quello dello spaziatore.
Per il caricamento si possono usare spesso anche pipette multicanale, accelerando così la procedura ed evitando la diffusione dei campioni.
Spaziatori
Gli spaziatori piatti sono disponibili in più spessori (0,2, 0,4, 0,5 mm fino a 2 mm) e per lunghezze di gel differenti.
Gli spaziatori a cuneo lineari sono offerti in diversi rapporti (ad esempio, 1:2, 1:3 e 1:4): la parte più sottile degli spaziatori può partire da 0,2 mm o 0,4 mm per tutti e tre i rapporti dei singoli spaziatori a cuneo.
Gli spaziatori cuneiformi esponenziali differiscono dai lineari per il fatto che per ogni gel si usano due set di spaziatori. La prima è una coppia di spaziatori piatti, seguita da una coppia di lineari. Gli spaziatori sono assemblati l'uno di seguito all'altro sulla lastra di vetro e il gel è versato usando le tecniche standard. In genere, i set di spaziatori cuneiformi esponenziali sono disponibili in due diversi rapporti (1:3 e 1:5) e ognuno di questi rapporti è disponibile per diverse lunghezze.
Reagenti e kit per le reazioni di sequenziamento
Si può scegliere se acquistare un set di desossinucleotidi (dNTP) o una mix di dNTP. Nel primo caso si tratta di 4 provette separate di dATP, dGTP, dCTP, dTTP ad una concentrazione di 100 mM. Le soluzioni di dNTP sono stabili a temperature costanti: +4°C, -20°C o -70°C. Per la conservazione a lungo termine è comunque consigliabile il frazionamento in aliquote.
Alternativamente, è disponibile una miscela pronta per l'uso di dATP, dGTP, dCTP e dTTP ad una concentrazione di 10 mM. Bisogna sempre tenere presente che i dNTP non sono stabili per la conservazione a lungo termine in soluzioni master mix pronte all'uso. Questi dNTP dovrebbero essere usati freschi ogni volta e consumati entro 48 ore.
La componente più costosa di una reazione di sequenziamento è in genere rappresentata dalla premix dei terminatori. In commercio esistono dei reagenti specialmente formulati per ridurre del 50% o più la quantità di premix di terminatori necessaria per ogni reazione di sequenza, mantendo la lunghezza di lettura, la risoluzione e l'intensità del segnale. Sviluppati per l'impiego con le più comuni chimiche disponibili, tra cui quella dei terminatori Big Dye o dei terminatori standard, questi reagenti possono essere aggiunti ad ogni reazione o alla soluzione premix stock (fig. 5).
Metodi di marcatura per il sequenziamento manuale
Per il sequenziamento manuale, oltre a usare un metodo di marcatura radioattiva, quali ad esempio la marcatura terminale del primer con 32P o l'uso di 35S dNTP, si possono impiegare dei metodi non isotopici meno rischiosi o anche meno costosi.
La maggior parte dei metodi non isotopici di sequenziamento manuale per la rilevazione necessita l'incorporazione di un primer di sequenza modificato all'interno dei prodotti di estensione. Le modificazioni tipiche includono biotinilazione e marcatura con digossigenina. Questi sistemi necessitano il trasferimento del gel di sequenza su una membrana prima della rilevazione: la sequenza viene quindi rilevata tramite metodi chemiluminescenti o colorimetrici. Invece, il metodo basato sul silver staining usa primer di sequenza non modificati e non ha bisogno di trasferimento (si colora il gel attaccato alla lastra di vetro). Ciò riduce i costi: non serve far sintetizzare dei primer modificati apposta per questa applicazione né spendere soldi per le membrane di trasferimento.
Rispetto ai metodi radioattivi, con il metodo del Silver staining si ottengono i risultati già 90 minuti dopo il completamento dell'elettroforesi, mentre per le autoradiografie spesso ci vogliono almeno 1-2 giorni di esposizione del gel. Non ci sono più i costi dei radioisotopi e si elimina anche il problema della loro eliminazione. Rispetto a una autoradiografia, però, per generare un segnale visibile con il silver staining è necessaria una maggiore quantità di DNA. Un esempio delle bande che si ottengono mediante colorazione Silver è mostrato in figura 6.
Marcatura fluorescente per il sequenziamento automatico
Il sequenziamento automatico utilizza in genere un singolo primer o molteplici primer marcati in modo fluorescente. Alcuni kit sono ottimizzati per l'uso con sistemi di sequenziamento automatico del DNA, che usano un singolo primer marcato con un fluorocromo dell'infrarosso (LI-COR). Altri invece sono adatti all'uso in sequenziatori che utilizzano un singolo primer fluorescente non infrarosso o molteplici primer marcati in modo diverso (ABI e ALF).
Sono da tempo disponibili in commercio sequenziatori automatici basati sulla fluorescenza, che operano con la modalità "1 colorante/4 corsie", analoga al tradizionale sequenziamento radioattivo con la tecnica di Sanger.
Tali metodi convenzionali di sequenziamento utilizzano una corsia separata per ogni reazione di estensione (1 colorante/4 corsie), il che aumenta la variabilità dovuta alle variazioni da corsia a corsia.
Correndo invece le 4 basi in un'unica corsia (4 coloranti/1 corsia) il sistema elimina questa variabile e aumenta la produttività (fig. 7). Attualmente è proprio questo il metodo più usato.
La marcatura dei primer utilizzati per il sequenziamento consiste nell'aggiunta di una coda ("tag") rappresentata da un colorante fluorescente. Per il sequenziamento di frammenti clonati, in commercio vi sono un gran numero di primer di sequenza che vanno dai comuni primers di M13, a quelli per lambda gt10 e 11, ai primer di sequenza per il promotore di T7 e SP6, fino ai primer specifici per singoli plasmidi. I primers possono essere marcati con fluoresceina o con altri coloranti fluorescenti (come il Texas Red) e il rilevamento è diretto tramite strumenti di sequenza automatica.
Oppure si può procedere all'incorporazione enzimatica di molecole di dATP marcate con una procedura brevettata denominata "cycle labeling and sequencing" (CLS), usando SequiTherm DNA polimerasi o Thermo Sequenase e primer non marcato.
La principale alternativa alla marcatura con un singolo primer o molteplici primer marcati con tag fluorescenti è però rappresentata dall'impiego di ddNTP marcati con 4 fluorocromi o coloranti differenti.
I kit che utilizzano ddNTP marcati con 4 fluorocromi diversi permettono di utilizzare i propri primer nonché un solo tubo di reazione invece di 4 tubi, riducendo i pipettaggi e le manipolazioni e permettendo di aumentare anche il numero di campioni che si possono caricare per gel.
Una tecnologia di marcatura particolarmente utilizzata è quella dei BigDye che, possono essere legati ai ddNTP o ai primer, permettendo di eseguire le reazioni di sequenza in un singolo tubo. I primer e i terminatori BigDye sono sistemi a trasferimento di energia a singola molecola, costituiti da un accettore e da un donatore collegati da un linker, che producono un segnale estremamente omogeneo e con bassissimo rumore di fondo.
I coloranti fluorescenti IR forniscono un'eccellente sensibilità, dato l'alto rapporto tra fluorescenza del colorante e la bassa fluorescenza di fondo. Alle lunghezze d'onda dell'infrarosso, la fluorescenza background proveniente da biomolecole, gel e vetri per sequenza è bassa, fornendo un ampio range dinamico di rilevazione e un'alta sensibilità.
Sequenziatori automatici
di DNA
Uno dei più importanti sviluppi nel sequenziamento del DNA è stata l'introduzione di apparecchiature automatiche per l'elettroforesi e l'analisi dei prodotti di sequenza.
La tecnologia del sequenziamento automatico prevede la rivelazione di frammenti di DNA marcati in modo fluorescente man mano si spostano lungo il gel elettroforetico che è irradiato da un laser. La fluorescenza emessa è raccolta da un detector posto a una distanza fissa dai pozzetti. Il segnale risultante produce un pattern di bande che correla con una sequenza di DNA o con le dimensioni di uno specifico di DNA per applicazioni di genotipizzazione.
Nei sequenziatori automatici che utilizzano slab gel il lavoro manuale dell'operatore consiste esclusivamente nel portare a termine le reazioni, nel versare il gel (laddove non si usa un gel preformato) e nel caricamento dei campioni nei pozzetti.
Nei sistemi automatici in cui l'elettroforesi avviene nei capillari, invece, le procedure manuali sono praticamente inesistenti.
Sequenziatori automatici basati sull'elettroforesi capillare
In questi sistemi, non è necessario versare e caricare il gel : il sistema carica automaticamente il capillare con il polimero, inietta i campioni nell'ordine specificato dall'operatore, esegue la separazione elettroforetica e analizza i dati.
Una volta che il rack portaprovette o la micropiastra con i campioni è correttamente posizionata, un autocaricatore trasferisce fino a 96 campioni per corsa ai pozzetti di iniezione e li analizza secondo i parametri definiti dal ricercatore. Si possono posizionare fino a 4 piastre di 96 o 384 pozzetti (per un massimo di 1536 campioni) sulla superficie di lavoro dello strumento. Quando una corsa è completata, il sistema ripete il ciclo per le 24 ore successive. In tal modo tutti i campioni caricati possono essere processati in corse successive prima che si renda necessaria la sostituzione delle micropiastre contenenti i campioni da sequenziare con nuove piastre.
I sequenziatori automatici basati sull'elettroforesi capillare possono essere: a capillare singolo, a 96 capillari per l'analisi automatica di migliaia di campioni al giorno (scala di produzione) e a 16 capillari.
A causa del meccanismo di iniezione elettrocinetica impiegato, il campione preparato (in genere proveniente da reazioni di cycle sequencing) deve essere totalmente privo di sali e di altre molecole cariche negativamente, perché questi competerebbero con il DNA per l'ingresso nel capillare durante l'iniezione, con una conseguente perdita di segnale. Inoltre, proteine, detergenti e templati di DNA non marcati potrebbero causare l'intasamento dei capillari, con una perdita di risoluzione. Vista l'importanza della purificazione, i sistemi basati sull'elettroforesi capillare vengono venduti con una serie di protocolli adatti allo scopo.
La rilevazione
I frammenti di DNA marcati con i fluorocromi sono rilevati durante l'elettroforesi mediante un microscopio a fluorescenza o una camera CCD (charge-coupled device).
Diversamente dai sistemi con punto focale fisso, il microscopio a fluorescenza con la sua ottica confocale può essere mosso e rifocalizzato al punto ottimale di rivelazione quando cambia lo spessore del gel o quando è introdotta qualche altra variabile.
I dati sono raccolti man mano che il laser/microscopio effettua la scansione del gel.
Oltre ai modelli a singola lettura, esiste in commercio un sistema di analisi del DNA nel vicino infrarosso (Near IR-NIR) a due coloranti, in grado di rivelare i prodotti di due diverse reazioni di sequenza in parallelo. In tal modo, sono ora possibili diversi approcci come le reazioni di "pooling" e di sequenziamento simultaneo bidirezionale (SBS), che permettono di ottenere il doppio delle informazioni da un singolo templato di DNA, nonché di ridurre il costo di ogni reazioni di sequenza e il numero di gel necessari.
Questo sequenziatore di DNA in fluorescenza NIR ospita due laser e due rilevatori. I frammenti di DNA marcati con i fluorofori sono rilevati durante l'elettroforesi mediante un microscopio a fluorescenza. Due immagini separate del gel, ognuna corrispondente ai dati di fluorescenza raccolti per ogni fluoroforo, sono prodotte in tempo reale per le quattro corsie di sequenza (A,T,G e C).
Altri sistemi utilizzano una camera CCD ad altissima risoluzione (50µm/pixel) che rivela l'emissione in fluorescenza dei campioni analizzati, offrendo all'utilizzatore, in pochi minuti, l'immagine, l'elettroferogramma e la sequenza. La tecnologia CCD ha il grande vantaggio che consente di adottare coloranti con qualsiasi lunghezza d'onda di emissione senza dover disporre di filtri specifici - complicati e costosi - necessari nei sistemi con rivelazione tramite tubo PMT (fig. 8).
Usando una camera CCD e una tecnologia di marcatura multicolore per la rilevazione di quattro coloranti in una sola corsia, si ottiene un'elevata produttività. In questo caso il sequenziatore può raccogliere i dati dei campioni a una velocità di 200 o 300 basi/ora. A questa velocità, si possono correre fino a 3 gel di medie dimensioni (36 cm) in meno di 8 ore.
Software di analisi di sequenza
I sequenziatori sono sotto il controllo di specifici programmi software. Il software permette di controllare i parametri elettroforetici, oltre che di gestire l'analisi e l'elaborazione dei dati. Quando si definisce una corsa, il software di controllo permette di scegliere un modulo di corsa ottimizzato per la velocità di corsa, la distanza di separazione, lo spessore del gel, la temperatura e il voltaggio applicato, e di ridurre al minimo le variazioni tra corsia e corsia, come anche l'effetto "smile".
Il software definisce in automatico le corsie per ogni campione e poi sequenzia uno dopo l'altro tutti i campioni. Se l'immagine presenta una qualsiasi anomalia, come "smile" o differenze nella mobilità delle corsie, questa può essere automaticamente corretta dal software di autosequenza.
Alcuni tipi di software particolarmente avanzati usano algoritmi che producono risultati ottimali con i campioni più diversi. Per la maggior parte dei campioni l'algoritmo standard offre un'altissima accuratezza - anche nei casi di campioni ricchi di G-C e con picchi di ampiezza variabile. Quando la mobilità e la spaziatura dei picchi esce dal range standard, vengono usati dei nuovi algoritmi che misurano in modo dinamico le caratteristiche dei dati prima dell'identificazione.
In alcuni sistemi è possibile passare alla modalità semi-automatica di identificazione delle basi che combina l'identificazione delle basi assistito dal computer con l'esperienza dell'operatore. Con questa modalità, il computer indica l'ultima base nella sequenza e l'operatore accetta la scelta, o indica una base diversa cliccando col mouse.
Il software di analisi offre diverse funzioni tra cui il potenziamento dell'immagine, la sottrazione del background, la normalizzazione delle bande, controlli di luminosità e contrasto, e il colore.
I dati di sequenza possono essere presentati sotto forma di bande o sotto forma di picchi cromatografici a quattro colori, oppure ancora sotto forma di sequenza con le lettere ACGT che indicano le singole basi identificate (fig. 9 e fig. 10).
la tecnica di sequenziamento secondo sangerLa tecnica, che prende il nome dal suo scopritore, usa uno stampo di DNA a singola elica, un breve primer di DNA e una DNA polimerasi per sintetizzare un'elica di DNA complementare. Il primer viene fatto appaiare al templato a singola elica (annealing), poi la miscela di reazione è divisa in 4 aliquote e vengono aggiunti deossinucleosidi trifosfati (dNTPs) e un dideossinucleoside trifosfato (ddNTP) diverso per ogni aliquota. Ogni volta che l'enzima DNA polimerasi incorpora un ddNTP in corrispondenza della sua base complementare sul templato, nessun altro dNTP potrà essere aggiunto alla catena nascente, Poichè il ddNTP manca del gruppo 3' OH. Il rapporto di concentrazione di ddNTP e dNTP è tale che l'enzima terminerà la catena nascente a tutte le posizioni in cui il ddNTP può essere inserito, formando così una serie di frammenti sfasati in 3' che condividono tutti l'estremità del primer. Uno dei dNTP in ciascuna reazione è marcato in modo che quando le quattro reazioni sono corse in un gel denaturante di poliacrilammide e una lastra autoradiografica è posta a contatto del gel, si genera un pattern di bande da cui si legge la sequenza del DNA.
La DNA polimerasi più usata con questa tecnica è la T7 DNA polimerasi, che permette di leggere sequenze brevi (400-500 basi dal primer) e sequenze lunghe (fino a 800-1000 nucleotidi), a seconda dei rapporti dNTPs:ddNTP presenti nella miscela di terminazione.
METODI di sequenziamento in base alla lunghezza del templato
Inserti di dimensioni inferiori a 5 Kb
Possono essere sequenziati usando la strategia del "walking primer". La strategia consiste nella definizione di un nuovo sito di priming in base alla sequenza ottenuta con il primo primer. Ciò permette di sintetizzare un nuovo oligonucleotide da utilizzare come primer per sequenziare il tratto immediatamente a valle e così via.
Allo stesso tempo, si può disegnare un primer per la direzione opposta (che sequenzia cioè il filamento complementare al primo in direzione contraria) per confermare i dati di sequenza ottenuti dal primo "walk".
Inserti di dimensioni maggiori di 5 Kb
Devono essere subclonati e la sequenza dovrebbe essere effettuata su subcloni parzialmente sovrapposti (cloni overlapping).
Una strategia possibile è il metodo delle delezioni "nested", che consiste nell'effettuare due set di delezioni che si estendono da estremità opposte del DNA bersaglio (inserto). Eseguendo delezioni da entrambe le estremità, bastano solo due primer di sequenza (forward e reverse) per determinare l'intera sequenza di entrambi i filamenti di DNA. Questo approccio implica però un certo lavoro di screening per trovare i cloni deleti corretti che coprono completamente l'inserto di DNA bersaglio.
alcune informazioni sul silver staining
Come funziona
Dopo l'elettroforesi, il gel di sequenza viene fissato in acido acetico per rimuovere il tampone di corsa e l'urea dal gel, e per prevenire la diffusione dei prodotti di estensione di piccole dimensioni. Il fissativo è successivamente eliminato con diversi lavaggi in acqua distillata. Il gel viene quindi colorato con una miscela di sali d'argento (in genere nitrato d'argento) e formaldeide. Dopo la colorazione il gel viene lavato brevemente in acqua per poi essere sviluppato in un tampone alcalino di carbonato di sodio contenente formaldeide e tiosolfato di sodio. In queste condizioni gli ioni d'argento sono ridotti ad argento metallico dalla formaldeide. L'aggiunta di tiosolfato di sodio previene la riduzione degli ioni d'argento liberi ad argento metallico, che altrimenti sarebbe una fonte di background. Una volta trascorso il tempo di sviluppo ottimale, il gel viene lavato brevemente ed essiccato all'aria.
Come si ottiene una copia permanente del gel
Per ottenere una registrazione permanente dei gel di sequenza colorati mediante Silver staining si consiglia l'uso di una pellicola APC (Automatic Processor Compatible). Si tratta di una pellicola positiva che produce un'immagine diretta dell'originale su un fondo bianco opaco. La foto del gel viene fatta dopo averlo sistemato su un transilluminatore a luce bianca. L'uso di pellicole APC ha anche il vantaggio che le bande debolmente colorate sono intensificate sull'immagine positiva.
i vantaggi dell'elettroforesi capillare
per il sequenziamento automatico
L'uso dell'elettroforesi capillare per l'analisi del DNA offre una serie di vantaggi.
Con una dissipazione del calore più efficiente di quella degli slab gel, i capillari permettono di usare voltaggi di corsa più elevati, che producono una maggiore velocità di corsa. L'elettroforesi capillare permette di usare il metodo di iniezione elettrocinetico per il caricamento dei campioni nei capillari. Con questo tipo di iniezione, si possono iniettare contemporaneamente ben 96 campioni in una serie di capillari posti in parallelo in meno di 30 secondi. Inoltre, l'uso dell'elettroforesi capillare con un sistema di rilevazione sensibile richiede meno DNA per campione rispetto ai sistemi degli slab gel. Tuttavia, il vantaggio maggiore è rappresentato dall'eliminazione delle operazioni manuali, risultanti in una maggiore riproducibilità ed affidabilità dei risultati. Inoltre, non è necessario preparare né versare gli slab gel, non si devono caricare i campioni con le pipette né pulire le lastre di vetro.
moduli di un classico
sequenziatore automatico
Le apparecchiature per il sequenziamento automatico in fluorescenza consistono in genere di 3 moduli:
- un modulo elettroforetico dotato di raggio laser, di una serie di fotodiodi e di un microscopio a fluorescenza o di una camera CCD per la rilevazione, e una piastra termostatica che regola la temperatura, minimizzando l'effetto "smiling"
- un modulo che ospita l'alimentatore per l'elettroforesi e per il laser
- un computer IBM o Macintosh: nel pacchetto del computer è incluso il software che permette di gestire il controllo del sistema, il display, l'analisi, l'elaborazione e la stampa dei dati. I dati di sequenza possono essere presentati sotto forma di bande e/o sotto forma di picchi cromatografici a quattro colori.
due reazioni di sequenza particolari
Pooling
Con le reazioni di pooling, due templati possono essere sequenziati in modo indipendente con diversi coloranti fluorescenti, e i campioni possono essere mescolati prima del caricamento sul gel. Questo multiplexing 2X raddoppia il numero di canali utilizzabili per gel (da 64 a 128) permettendo l'analisi di fino a 32 reazioni di sequenziamento a singolo colorante.
Sequenziamento simultaneo bidirezionale Nel sequenziamento simultaneo bidirezionale (SBS) entrambi i filamenti di DNA (plasmide o prodotto PCR) sono sequenziati contemporaneamente quando si usano sia il forward primer che il reverse primer (ognuno marcato con un diverso fluoroforo) nella stessa reazione di sequenza.